維生素D簡介
維生素D(Vitamin D, VD)是維持人體健康必不可少的一類脂溶性維生素，具有促進腸道對鈣、鎂和磷酸鹽的吸收，調節機體免疫功能等多種生物功效。維生素D家族兩大重要成員是維生素D3(膽鈣化醇)和維生素D2(麥角鈣化醇)，它們合稱為鈣化醇。為了預防和治療維生素D缺乏，市場上有多種維生素D或復方滴劑供消費者選擇。
藥典0722維生素D測定第四法
2020版《中國藥典》四部通則《0722 維生素D測定方法》中采用高效液相色譜法測定維生素D及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經折算成維生素D的總量。在2015版基礎上，2020版藥典新增了第四法。該法采用正相二維液相色譜，供試品無需經過復雜處理即可進樣分析，大大節省了樣品前處理的時間。第四法一維色譜柱藥典委推薦采用以脲基鍵合硅膠為填充劑(2.1mm × 150mm, 3um)，該規格與賽默飛 Acclaim系列的HILIC-10色譜柱一致。其實，早在2010年左右，賽默飛液相團隊就已經向相關食品藥品檢驗院所推薦該色譜柱，共同探討研究采用二維液相色譜技術測定維生素D的方案，并結合賽默飛獨有的雙三元液相色譜儀器開展相關實驗。
圖1.雙三元二維液相系統連接示意圖
賽默飛特色雙三元液相
賽默飛雙三元液相早在2006年就已在市場推出，一經推出便得到行業內一致好評，并獲得當年匹茲堡金獎。其采用獨特的雙泵設計，每一個泵都可以獨立工作，有各自獨立的流動相比例閥和流動相進出系統，可以同時單獨控制三種不同的流動相來進行復雜的樣品分析。柱溫箱部分放置的兩個切換閥可以通過變色龍軟件的控制在相應的時間進行閥切換，實現流動相流路和色譜柱連接的不同組合切換。因此使用雙三元液相可以輕松實現2020版《中國藥典》維生素D測定第四法。
VC雙三元液相色譜條件
Vanquish™ Core(簡稱VC)雙三元液相采用模塊化設計，耐壓達700bar，可以兼顧常規液相及部分超高效液相工作。結合配套的正相套件，即可實現正相體系的使用。本實驗詳細條件如表1所示。
表1. 雙三元二維液相色譜條件
實驗結果
維生素D3校正因子f1對照品溶液和校正因子f2混合對照品溶液及供試品配置步驟參考藥典通則0722 維生素D測定法，實驗結果如下：
圖2.f2混合對照品溶液一維色譜圖(上)和二維色譜圖(下)
表2. f2混合對照品溶液一維色譜結果
由圖2及表2可見，采用雙三元液相色譜測定維生素D，前維生素D和維生素D的分離度良好，可已達到9.3，滿足藥典分離度大于5的要求；兩個峰的理論塔板數分別為9568及8798，均遠大于藥典要求的2300。
圖3. 某維生素D滴劑供試品一維色譜圖(上)和二維色譜圖(下)
圖3顯示該維生素D滴劑供試品一維色譜中，前維生素D 受基質干擾，與干擾峰分離度不佳，維生素D的峰形較寬。經過二維色譜后，前維生素D與干擾峰達到分離，兩個目標峰的峰形收窄，更利于維生素D的定量。
圖4. f2混合對照品溶液連續進樣5針疊加圖(上圖為一維，下圖為二維)
實驗對方法的重復性做了考察，結果顯示連續進樣5針，一維前維生素D及維生素D的保留時間RSD分別為0.88%及0.42%，峰面積RSD分別為1.42%及0.96%；二維前維生素D及維生素D的保留時間RSD分別為0.88%及0.42%，峰面積RSD分別為1.21%及0.80%，充分體現了雙三元液相兩泵的優良性能及整個液相系統的穩定性。
小結
隨著2020版藥典四部通則0512高效液相色譜法中引入了多維液相色譜(單中心切割、多中心切割和全二維色譜)的介紹，市場對于二維色譜的認知及了解逐漸廣泛，也涌現出越來越多二維液相方法，賽默飛特色的雙三元液相完全滿足各行各業用戶二維液相色譜的需求。除二維液相色譜應用外，賽默飛雙三元液相色譜儀同樣被廣泛應用于液質聯用在線除鹽，Online-SPE(在線固相萃取)，串聯及并聯液相以及特色電霧式檢測器CAD反梯度補償等高級應用，為廣大企業用戶降本增效。
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